【AAV熱點應用】Zetasizer精準表征rAAV顆粒粒徑及衣殼滴度

更新時間：2022-06-02 點擊次數：1724

腺相關病毒載體表征

腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一。其直徑約為20-26nm，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA。重組腺相關病毒載體（recombination AAV, rAAV）則是在非致病的野生型AAV基礎上改造而成的，因其具有：安全性高、免疫原性低；宿主細胞范圍廣（對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力）；體內表達時間長；血清型眾多，且具有組織特異性等特點被廣泛用于基因治療、疫苗等研究、應用領域[1]。

在rAAV的生產工藝中，有無團聚體（aggregate），以及衣殼滴度（titer）的高低是重點考察的關鍵質量屬性（CQAs）[2]，Zetasizer納米粒度儀通過對rAAV顆粒的粒徑及衣殼滴度的表征，快速實現該CQAs的鑒定。

納米粒度電位儀

馬爾文帕納科 Zetasizer Ultra

材料和方法

將兩種不同生產批次的rAAV分別用緩沖液稀釋至合適的濃度，利用Zetasizer Ultra-Red （Malvern Panalytical Ltd.）以及小體積石英比色皿（ZEN2112）進行相應的粒徑和滴度測定^[3]。樣品測試體積為20 µL，rAAV折射率、吸收率分別設置為1.45和0.001，緩沖液的散射光強度測定為80 kcps。

結果

通過多角度動態光散射（multi-angle DLS, MADLS）技術，我們分別對兩種批次的rAAV粒度大小及分布進行表征（圖1、3）?？梢钥吹?，批次1的rAAV只有一個粒徑分布峰，其值大小為28.2 nm，說明體系中沒有團聚體產生，而批次2的rAAV則呈現出3個粒徑分布峰，分別位于28.2、150.9以及430.6 nm，這說明體系中除了rAAV單體，還有團聚體產生。

此外，基于MADLS技術得到的顆粒的準確粒徑分布圖，我們還能得到對應尺寸的衣殼滴度（圖2、4）。

參考文獻

1. Mendell J R, Al-Zaidy S A, Rodino-Klapac L R, et al. Current Clinical Applications of in vivo Gene Therapy with AAVs. Molecular Therapy, 2021, 29 (2), 464-488.

2. Gimpel A L, Katsikis G, Sha S, et al. Analytical Methods for Process and Product Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus-based Gene Therapies. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2021, 20, 740-754.

3. Cole L, Fernandes D, Hussain M T, et al. Characterization of Recombinant Adeno-Associated Viruses (rAAVs) for Gene Therapy Using Orthogonal Techniques. Pharmaceutics, 2021, 13, 586.